蛋白質(zhì)印跡法是由瑞士米歇爾弗雷德里希生物研究所的Harry Towbin在1979年提出的。在尼爾·伯奈特于1981年所著的《分析生物化學(xué)》中首次被稱為Western Blot。蛋白免疫印跡是將電泳分離后的細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特異性抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質(zhì)檢測技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因在蛋白水平的表達(dá)研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個方面。

蛋白印跡發(fā)的原理是什么?

與Southern Blot或Northern Blot雜交方法類似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。

蛋白印跡法的操作步驟是什么?

試劑準(zhǔn)備

1、SDS-PAGE試劑：見電泳實驗。

2、勻漿緩沖液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.0ml;10%SDS6.0ml;β-巰基乙醇0.2ml;ddH2O 2.8ml。

3、轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸2.9g;Tris5.8g;SDS 0.37g;甲醇200ml;加ddH2O定容至1000ml。

4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl8.0g;KCl 0.2g;Na2HPO41.44g;KH2PO40.24g;加ddH2O至1000ml。

5、膜染色液：考馬斯亮藍(lán)0.2g;甲醇80ml;乙酸2ml;ddH2O118 ml。包被液(5%脫脂奶粉，現(xiàn)配)：脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。

6、顯色液：DAB 6.0mg;0.01M PBS 10.0ml;硫酸鎳胺 0.1ml;H2021.0μl。

樣品制備

1、單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取：

(1)倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液(或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫菏箽堄嗯囵B(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走)。

(2)每瓶細(xì)胞加3ml 4℃預(yù)冷的PBS(0.01M pH7.2～7.3)。平放輕輕搖動1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。

(3)按1ml裂解液加10 μlPMSF(100mM)，搖勻置于冰上。(PMSF要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合。)

(4)每瓶細(xì)胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動。

(5)裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)(動作要快)，然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中(整個操作盡量在冰上進(jìn)行)。

(6)于4℃下12000rpm離心5min(提前開離心機預(yù)冷)。

(7)將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到0.5ml的離心管中放于-20℃保存。

2、組織中總蛋白的提?。?/p>

(1)將少量組織塊置于1～2ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。

(2)加400 μL單去污劑裂解液裂(含PMSF)于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。

(3)幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。

(4)裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4℃下12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。

3、加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。河捎谑芩幬锏挠绊懀恍┘?xì)胞脫落下來，所以除按(一)操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提?。?/p>

(1)將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中，于2500rpm離心5min。

(2)棄上清，加入4ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。

(3)用槍洗干上清后，加100 μL裂解液(含PMSF)冰上裂解30min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。

(4)將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。

含量測定

1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

(1 )從-20℃取出1mg/mlBSA，室溫融化后，備用。

(2) 取18個1.5ml離心管，3個一組，分別標(biāo)記為0μg，2.5μg，5.0μg，10.0μg，20.0μg，40.0μg。

2、檢測樣品蛋白含量

(1)取足量的1.5ml離心管，每管加入4℃儲存的考馬斯亮藍(lán)溶液1ml。室溫放置30min后即可用于測蛋白。

(2 )取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15mol/LNaCl溶液100ul，混勻放置2分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按blank測空白樣品。

(3 )棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次(每次0.5mL)，再用無菌水洗一次。

(4) 取一管考馬斯亮藍(lán)加95ul 0.15mol/LNaCl溶液和5ul待測蛋白樣品，混勻后靜置2min，倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品。

注意：每測一個樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2次，無菌水洗一次?？赏瑫r混合好多個樣品再一起測，這樣對測定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時間。測得的結(jié)果是5ul樣品含的蛋白量。